داده‌اند که واکنش گياهان به افزايش دي اکسيد کربن در زماني که نيتروژن به ميزان کافي در دسترس نباشد، کمتر از زماني است که نيتروژن به ميزان کافي در دسترس است [5]. کيم و همکاران (2001) نشان دادند که همبستگي شديدي بين تامين نيتروژن و دي اکسيد کربن در گياه برنج وجود دارد، در شرايط افزايش دي اکسيد کربن ، جذب نيتروژن در غلظت پايين (4 گرم درمترمربع) 2 درصد و در غلظت بالا (12گرم درمترمربع) 20 درصد بود [52]. در آزمايش وراکون و همکاران (1999) نيز پاسخ زيست توده به افزايش غلظت دي اکسيد کربن در نيتروژن پايين (12 ميلي‌گرم) کم بود در حالي که با افزايش نيتروژن (36 ميلي‌گرم) افزايش چشمگيري داشت [82]. همچنين ژانگ و همکاران (2013) گزارش کردند با افزايش غلظت دي اکسيد کربن (200 ميکرومول در مول بيشتر) افزايش عملکرد برنج در شرايط عدم کاربرد نيتروژن ، 11 درصد در حالي که در شرايط استفاده از هشت گرم نيتروژن در متر مربع 16 درصد بود. ايشان بيان کردند که اين تفاوت در سطوح مختلف نيتروژن برهمکنش بين نيتروژن و دي اکسيد کربن را نشان ميدهد [85].

فصل سوم
مواد و روشها

اين مطالعه در قالب دو آزمايش جداگانه در شرايط گلخانه در سال 1392 به اجرا درآمد. در آزمايش اول، پاسخ ژنوتيپ‌هاي مختلف برنج به دو غلظت نيتروژن محلول غذايي مورد بررسي قرار گرفت. در آزمايش دوم پاسخ ژنوتيپ هايي با نيتروژن کارايي متفاوت، نسبت به افزايش غلظت دي اکسيد کربن هوا در سطوح مختلف غلظت نيتروژن محلول غذايي ارزيابي شد.
3-1- مواد ژنتيکي و نحوه تهيه
براي اجراي اين تحقيق از 28 ژنوتيپ برنج در سه گروه اصلاحي شمال، محلي شمال و مرکزي ايران استفاده شد. بذرها از موسسه تحقيقات برنج کشور در رشت، معاونت موسسه تحقيقات برنج در آمل و مرکز تحقيقات کشاورزي و منابع طبيعي اصفهان تهيه شدند. ژنوتيپهاي اصلاحي شمال عبارت بودند از: فجر، شيرودي، پويا، نعمت، دشت، خزر، کشوري، تابش، بجار، شفق، سپيدرود، ندا و کوهسار. ژنوتيپهاي محلي شمال عبارت بودند از: ديلماني، عليکاظمي، حسني، طارم منطقه، طارم محلي، دم سرخ، اهلمي طارم، محمدي چپرسر، هاشمي، صدري، غريب و موسي طارم. ژنوتيپهاي مرکزي ايران عبارت بودند از: لاين2فيروزان، سازندگي، زاينده رود و محلي جوزدان.
3-2- محلول غذايي مورد استفاده و نحوه کشت
به منظور کشت از محلول غذايي يوشيدا، بر اساس روش يوشيدا (1976) استفاده شد [83]. بدين منظور ابتدا محلول مادر هر يک از عناصر غذايي مورد نياز مطابق جدول (3-1) تهيه شد. سپس براي تهيه محلول غذايي 5/12 ميلي ليتر از هر يک از محلولهاي مادر به 10 ليتر آب مقطر اضافه شد. از مرحله شروع پنجهزني حجم محلول غذايي به 20 ليتر ارتقاء يافت و به صورت هفتگي تعويض ميشد. اسيديته محلول (pH) با اضافه کردن NaOH و HCl کنترل و حدود 7/5 تنظيم شد. قابليت هدايت الکتريکي (EC) در طول دوره آزمايش حدود 5/2 دسي‌زيمنس در متر بود.
بذر ژنوتيپهاي مورد نظر ابتدا به وسيله‌ي محلول هيپو کلريت سديم 2 درصد ضدعفوني شده و جهت جوانه زني و سبز شدن در ظروف کوچک تا رسيدن گياهچهها ‌‌به مرحله دو برگي نگهداري شدند و سپس گياهچهها به ظرف‌هاي حاوي محلولهاي تهيه شده منتقل شدند. جهت استقرار گياهچهها در ظروف حاوي محلول غذايي از صفحات يونوليت با سوراخهايي به فاصله پنج سانتيمتر از يکديگر استفاده شد. به منظور نرسيدن نور به محلول غذايي دور ظروف کشت با پلاستيک مشکي پوشانيده شد.
جدول 3-1 ترکيب محلول غذايي يوشيدا و غلظت محلولهاي مادر مورد استفاده
عناصر
غلظت در محلول مادر (گرم در ليتر)
غلظت در محلول غذايي
پر مصرف

NH4NO3
4/91
43/1mM
NaH2PO4.2H2O
3/40
323µM
KSO4
4/71
512 µM
CaCl2.2H2O
6/88
750 µM
MgSO4.7H2O
324
64/1mM
کم مصرف

MnCl2.4H2O
49/1
45/9 µM
(NH4)6.Mo7O24.4H2O
072/0
07/0 µM
H3BO3
928/0
7/18 µM
ZnSO4.7H2O
032/0
139/0 µM
CuSO4.5H2O
032/0
139/0 µM
FeCl3.6H2O
69/7
6/35 µM
3-3- نحوه اجراي طرح
3-3-1- آزمايش اول
اين آزمايش به منظور ارزيابي پاسخ 28 ژنوتيپ برنج به کمبود نيتروژن در مرحله رشد رويشي در بهار سال 1392 در گلخانه تحقيقاتي مرکز کشت بدون خاک دانشگاه صنعتي اصفهان اجرا شد. ميانگين دماي اين گلخانه در طول اجراي آزمايش 27 درجه سانتي گراد و ميانگين رطوبت نسبي هوا 40 درصد بود. آزمايش به صورت فاکتوريل در قالب طرح پايه کاملا تصادفي با سه تکرار در دو سطح نيتروژن شامل 85/2 (غلظت نيتروژن محلول يوشيدا) و 42/1 (نصف غلظت نيتروژن محلول يوشيدا) ميلي‌مولار از منبع نيترات آمونيوم محلول غذايي يوشيدا انجام شد. تيمار نيتروژن بعد از سه برگي شدن گياهچهها اعمال شد و سه هفته بعد از اعمال تيمار گياهچهها برداشت شدند.
3-3-2- آزمايش دوم
اين آزمايش به منظور ارزيابي پاسخ ژنوتيپ‌هايي با پاسخ متفاوت به کمبود نيتروژن، نسبت به افزايش غلظت دي اکسيد کربن هوا در پاييز و زمستان سال 1392 در گلخانه آموزشي و پژوهشي دانشکده کشاورزي دانشگاه صنعتي اصفهان اجرا شد. ميانگين دماي محيط آزمايش 26 درجه سانتيگراد و ميانگين رطوبت نسبي 80 درصد بود. در اين مرحله چهار ژنوتيپ شامل فجر و حسني (نيتروژن کارا) و شيرودي و طارم منطقه (نيتروژن ناکارا) در چهار سطح نيتروژن محلول غذايي شامل 712/0، 42/1، 85/2 و 79/3 ميلي‌مولار از منبع نيترات آمونيوم در محلول غذايي يوشيدا و دو سطح دي اکسيد کربن معمول (حدود 360 ميکرومول در مول) و غني‌شده هوا (حدود 700 ميکرومول در مول) طي آزمايشي که به صورت فاکتوريل در قالب طرح کاملا تصادفي در دو محيط با سه تکرار (هر تکرار ميانگين سه بوته) انجام شد، مورد ارزيابي قرار گرفتند. براي اعمال تيمار غني سازي دي اکسيد کربن،گاز از طريق کپسول‌ گاز دي اکسيد کربن به داخل فضايي با حجم تقريبي 15 متر مکعب که توسط پلاستيک از محيط اطراف جدا شده بود، تزريق شد. غلظت دي اکسيد کربن محيط روزانه توسط دستگاه ديجيتال اندازه گيري غلظت دي اکسيد کربن کنترل و تنظيم ميشد. تيمار دي اکسيد کربن و نيتروژن 30 روز بعد از کشت بذور (سه برگي شدن گياهچهها) اعمال شد. گياهان در دو مرحله، 30 روز بعد از اعمال تيمار (اواسط مرحله پنجه زني) و 60 روز بعد از اعمال تيمار (اواسط مرحله خوشه دهي) برداشت شدند.
3-4- صفات مورد بررسي و نحوهي اندازه گيري
3-4-1 ارتفاع گياهچه
ارتفاع گياهچهها با خطکش ميليمتري از محل طوقه تا آخرين برگ توسعه يافته اندازهگيري شد.
3-4-2- طول ريشه
طول ريشه با خطکش ميليمتري از محل طوقه تا انتهاي محل تجمع ريشهها اندازهگيري شد.
3-4-3- تعداد پنجه
تعداد پنجه با شمارش تعداد ساقه به غير از ساقه اصلي در بوته محاسبه شد.
3-4-4- حجم ريشه
از طريق اختلاف حجم ايجاد شده پس از قرار گيري ريشه در حجم مشخصي از آب بر حسب سانتي متر مکعب در بوته محاسبه شد.
3-4-5- سطح برگ
سطح برگ با استفاده از دستگاه سطح برگ سنج الکترونيکي ( Green Leaf Area Tester model GA-5) بر اساس سانتي متر مربع در بوته بهدست آمد.
3-4-6- وزن خشک گياه
بدين منظور نمونههاي وزن اندام هوايي و ريشه پس از جداسازي ابتدا در دماي 70 درجه سانتيگراد در داخل دستگاه خشک کن به مدت 48 ساعت قرار داده شدند و سپس با ترازوي ديجيتال توزين گرديدند. (هر تکرار شامل سه بوته بود.)
3-4-7- سهم ريشه از وزن خشک کل
سهم ريشه با محاسبه درصد وزن خشک ريشه از وزن خشک کل گياه بدست آمد.
3-4-8- شاخص سبزينگي (عدد کلروفيل)
اندازهگيري شاخص سبزينگي از محل آخرين برگ توسعه يافته با استفاده از دستگاه SPAD مدل(Konica Minolta) صورت گرفت. (هر تکرار شامل سه بوته و هر بوته سه بار اندازهگيري شد.)
3-4-9- غلظت کلروفيل و کاروتنوييد
براي اندازه گيري غلظت کلروفيل و کاروتنوئيد از روش ليچتن چالر [55] با اعمال تغييراتي در آن استفاده شد. براي اين منظور نمونه هاي برگ برداشت شده، در داخل فويل و درون نيتروژن مايع قرار داده شدند تا هر گونه واکنش انجام شده متوقف شده و از تجزيه کلروفيل جلوگيري شود. سپس نمونهها در دماي 20- درجه سانتي گراد يخچال قرار داده شدند. هنگام اندازهگيري کلروفيل، نمونههاي برگ فريز شده با نيتروژن مايع در هاون چيني پودر شدند. بعد از آن 1/0 گرم از هر نمونه پودر شده به داخل ميکروتيوب يک ميليليتري منتقل شد. و مقدار 500 ميکروليتر استون 80 درصد به آن اضافه گرديد. نمونهها بعد از ورتکس و يکنواخت شدند در دماي پخچال به مدت 24 ساعت نگه داري شدند. بعد از خروج نمونهها از يخچال ابتدا ورتکس شده سپس به مدت 10 دقيقه با سرعت 4000 دور در دقيقه سانتريفيوژ شدند. پس از سانتريفيوژ از فاز جدا شده بالايي توسط سمپلر 50 ميکروليتر برداشته و داخل ميکروتيوب هاي جديد انتقال داده شد. سپس 950 ميکروليتر استون 80 درصد به آن اضافه شد تا حجم نهايي به يک ميليليتر برسد. سپس با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر مدل(Spectrophotometr, Model: UV-2100, Unico) ميزان جذب عصارهها در طول موج هاي 2/663، 8/646 و 470 نانومتر خوانده شد. براي کاليبرهکردن دستگاه از بافر استخراج يعني استون 80 درصد استفاده شد. براي محاسبه ميزان کلروفيل a، b و کاروتنوييد برحسب ميلي گرم در گرم وزن تر برگ از فرمولهاي زير استفاده شد.
معادله 4-1
معادله 4-2
معادله 4-3
معادله 4-4
معادله 4-5
معادله 4-6

3-4-10- غلظت نيتروژن بافت گياهي
براي تعيين نيتروژن کل از روش نووزامسکي و همکاران [61] استفاده شد. تعيين نيتروژن در اين روش بر اساس واکنش برتلوت است. طي اين واکنش يک ترکيب فنلي ( ساليسيلات) در حضور آمونياک و هيپوکلريد به رنگ سبز آبي در ميآيد و ميزان جذب توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 660 نانومتر اندازه گيري ميشود. روش کار به صورت زير بود.
– آماده سازي مخلوط هضم:
42/30 ميلي ليتر آب را در يک ارلن 250 ميلي ليتري ريخته (سرد باشد) سپس 169 ميلي ليتر اسيد سولفوريک و 6 گرم ساليسيليک اسيد در آن حل کرديم.
– روش هضم:
از نمونه گياهي خشک شده 3/0 گرم را وزن کرده و در بالن 50 ميلي ليتري ريختيم. سپس 3/3 ميلي ليتر از مخلوط هضم را به آن اضافه کرده و خوب مخلوط کرديم. نمونه هضم را به مدت يک شب در دماي اتاق قرار داديم. نمونه هضم خالي را نيز آماده کرديم (Blank). سپس بالن را در دماي 180 درجه بر روي گرمکن به مدت يک ساعت قرار داديم. بعد از سرد شدن 5 قطره هيدروژن پراکسيد به آن اضافه کرديم. دوباره بالن را به مدت 5 الي 10 دقيقه در دماي 280 درجه قرار داديم تا بخار سفيد مشاهده شود. دوباره 5 قطره هيدروژن پراکسيد به آن اضافه کرده و حرارت داديم. اين کار را آنقدر ادامه داديم تا هضم بي رنگ شود. بعد اجازه داديم در دماي اتاق سرد شود و با آب به حجم 50 ميلي ليتر رسانديم و از کاغذ صافي عبور داديم.
بعد از پايان مرحله هضم براي قرائت ميزان جذب نيتروژن با دستگاه اسپکتروفتومتر محلولهاي زير را به ترتيب تهيه کرديم.
– محلول استوک آمونيوم سولفات
179/1 گرم NH4)2SO2 ( را در آب حل کرده و به حجم 100 ميلي ليتر رسانديم. (به خوبي پودر شد و قبل از توزين در دماي 105 درجه خشک شد)
– محلول سديم هيدروکسيد
40 گرم NaOH را در 100 ميلي ليتر آب حل کرديم. (بعد از سرد شدن به

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید